熒光PCR試劑盒能夠檢測(cè)極低拷貝數(shù)的目標(biāo)核酸序列，可達(dá)到單拷貝甚至亞單拷貝級(jí)別。這使得在微量樣本檢測(cè)中，如痕量病原體檢測(cè)、稀有突變基因篩查時(shí)，依然能獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，為早期診斷、疾病監(jiān)測(cè)以及基礎(chǔ)研究中對(duì)低豐度基因表達(dá)分析等提供了可能。無論是熒光探針法還是結(jié)合熔解曲線分析的SYBRGreenI染料法，都能有效區(qū)分目標(biāo)序列與非目標(biāo)序列。探針法基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)特異性探針，僅在與匹配的模板結(jié)合時(shí)才會(huì)被切斷產(chǎn)生熒光；SYBRGreenI染料法通過優(yōu)化引物設(shè)計(jì)及熔解曲線分析，排除非特異性擴(kuò)增干擾，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確反映目標(biāo)基因的擴(kuò)增情況。
 

　　區(qū)別于傳統(tǒng)PCR只能在終點(diǎn)通過凝膠電泳等手段分析擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光PCR試劑盒可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程。研究人員能在反應(yīng)過程中即時(shí)獲取數(shù)據(jù)，不僅節(jié)省時(shí)間，還能準(zhǔn)確判斷擴(kuò)增效率、確定循環(huán)數(shù)，避免過度擴(kuò)增導(dǎo)致的平臺(tái)效應(yīng)影響定量準(zhǔn)確性，尤其適用于動(dòng)力學(xué)研究以及對(duì)初始模板量快速評(píng)估的場(chǎng)景。借助精密的熒光檢測(cè)設(shè)備與數(shù)據(jù)分析軟件，依據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系(如閾值循環(huán)數(shù)Ct值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法或相對(duì)定量法，能夠準(zhǔn)確計(jì)算出目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)或相對(duì)表達(dá)水平。這一特性在基因表達(dá)調(diào)控研究、病原體載量測(cè)定、轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)等方面具有不可替代的價(jià)值。
 

　　熒光PCR試劑盒的測(cè)定步驟：
 

　　1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
 

　　-試劑與儀器準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好引物、熒光探針(若為探針法)、酶、dNTPs、緩沖液等，以及合適的模板DNA或RNA樣品、熒光定量PCR儀、移液器、離心管等器材。
 

　　-引物與探針設(shè)計(jì)或選用：根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針(若采用探針法)，確保其具有高特異性和擴(kuò)增效率，也可從試劑盒配套或商業(yè)渠道獲取已驗(yàn)證的引物和探針。
 

　　-樣品處理：提取待測(cè)樣品中的核酸(DNA或RNA)，如使用商業(yè)核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，并測(cè)定核酸的純度和濃度，必要時(shí)進(jìn)行稀釋，使其濃度適合PCR反應(yīng)。
 

　　2.反應(yīng)體系配置
 

　　-計(jì)算試劑用量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目標(biāo)序列長(zhǎng)度，計(jì)算出所需的各種試劑用量，通常反應(yīng)體系體積在20-50μL范圍內(nèi)。
 

　　-混合試劑：按照試劑盒說明，將引物、熒光探針(若使用)、酶、dNTPs、緩沖液、模板核酸等依次加入離心管中，輕輕混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。
 

　　3.PCR擴(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)
 

　　-設(shè)置反應(yīng)條件：根據(jù)所用的PCR試劑盒和目標(biāo)分子特性，在熒光定量PCR儀上設(shè)置合適的反應(yīng)條件，一般包括變性(95℃左右，10-15分鐘，激活Taq酶)、循環(huán)擴(kuò)增(95℃變性15-30秒，60℃左右退火/延伸30-60秒，共40-50個(gè)循環(huán))等階段。
 

　　-放入儀器檢測(cè)：將配置好的反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀中，啟動(dòng)程序。在每個(gè)循環(huán)的退火/延伸階段，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。
 

　　4.數(shù)據(jù)分析
 

　　-確定Ct值：儀器根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)進(jìn)行記錄。
 

　　-定量分析：可采用絕對(duì)定量(通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣本的Ct值計(jì)算起始拷貝數(shù))或相對(duì)定量(通過比較目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值差異，如ΔΔCt法，計(jì)算基因表達(dá)水平)的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
 

　　-熔解曲線分析：進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保無非特異性擴(kuò)增。